İklim Değişikliği ve Akdeniz'de Deniz Müsilajı ve Mikrobiyal Patojenlerin Potansiyel Yayılımı
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2739426/
İklim Değişikliği ve Akdeniz'de Deniz Müsilajı ve Mikrobiyal Patojenlerin Potansiyel Yayılımı
İlişkili Veriler
Giriş
Deniz karı (yani, boyutları birkaç milimetreden birkaç metreye kadar değişen amorf agregalar) Dünya okyanuslarında her yerde bulunur [1] . Yaz koşulları altında su sütunu tabakalaşması, topluca deniz müsilajı olarak bilinen büyük kütleli tabakalar, ince tabakalar, topaklar ve bulutlar halinde küçük boyutlu agregaların aşamalı bir şekilde birleşmesini desteklemektedir [2] . Müsilaj, deniz karının jelatinimsi gelişen bir aşamasıdır (Şekil 1), devasa boyutlara ulaşabilen ve yüzlerce kilometrelik kıyı şeridi alanlarını kaplayan [3] – [6] .
Numune alındıktan sonra (B) yüzeydeki açık deniz sularındaki (A) ve ileri bir birleşme aşamasındaki müsilajın görüntüsü.
Musilaj deniz organizmaları tarafından salınan yüksek koloidal özelliklere sahip exopolymeric bileşikler yapılır : [7] stresli koşullar altında üretilen photosyntetically türetilmiş karbonhidrat fitoplankton sızması da dahil olmak üzere, farklı süreçlerle [8] , [9] (örneğin, p-sınırlı Diatomlar bu büyük miktarlarda polisakkarit üretir [10] – [14] ) ve hücre duvarı kalıntılarının ölümü ve ayrışması yoluyla [15] , [16] . Böyle bir salıverme, prokaryotların hücre dışı enzimler aracılığıyla bu ekzopolimerleri hidrolize etme konusundaki sınırlı yeteneği ile birleştirilebilir [17] – [18]sistemde büyük moleküler ağırlıklı bileşiklerin salınmasına ve birikmesine yol açar [19] – [26] . Bu süreçler, prokaryotların ve fitoplanktonların viral enfeksiyonları ve bunun sonucunda su sütununda çözünmüş organik maddenin salınmasına ve birikmesine katkıda bulunan hücre lizizi (viral şant) ile ilişkilendirilebilir [27] – [31] . Denizde müsilaj oluşumunu tetikleyen sebepler ne olursa olsun, bu fenomen sosyo-ekonomik sonuçları nedeniyle kıyı bölgelerinde artan bir endişe yaratmıştır.
Dünya çapında, Akdeniz havzasındaki son derece verimli ve sığ Adriyatik Denizi (ve özellikle kuzey kısmı), büyük deniz müsilajlarının patlamasından en ciddi şekilde etkilenen alandır. Müsilaj burada ilk kez 1729'da rapor edildi ve başlangıçta balık ağlarının tıkanmasına neden olduğu için “kirli deniz” fenomeni (“mare sporco”) olarak tanımlandı [32] . O zamandan beri, müsilaj varlığı sporadik olarak rapor edilmiştir, ancak son otuz yılda bu fenomenin sıklığı önemli ölçüde artmış gibi görünmektedir [2].. Müsilaj varlığı, üretilen kötü koku ve müsilajın banyo yapanların derisine yapışması nedeniyle deniz suyunu banyo için uygun hale getirir. Yüzeyde veya su sütununda yüzen deniz müsilajları uzun bir yaşam süresi (2-3 aya kadar) gösterebilir ve bir kez deniz dibine yerleştikten sonra bu büyük agregalar tortuları kaplar, bazı durumlarda km'ler boyunca uzanır ve hipoksik ve /veya anoksik koşullar [2] . Bunun sonucunda bentik organizmaların (dip ile ilişkili nekton dahil) boğulması [24] turizm ve balıkçılığa ciddi ekonomik zararlar verir [33] .
Bu çalışmada şunları varsaydık: i) deniz musilajı, patojenik formlar da dahil olmak üzere mikrobiyal kolonizasyon için kısa ömürlü olsa da yeni bir substratı temsil edebilir, ii) Akdeniz'de artan müsilaj salgınları sıklığı son iklim değişikliği ile bağlantılıdır ve iii) artan deniz müsilaj oluşumu deniz hastalıklarının yayılmasını artırabilir.
Sonuçlar
Deniz müsilajı ile ilişkili virüsler ve prokaryotlar
Mikroskopik denizcilik zamk örnekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir (ortalama 3.76 ± 2.53 10 üzerinde büyük bir prokaryotik, viral bolluk varlığını ortaya çıkardı analiz 6 hücreleri ve 1.11 ± 0.26 10 9 virüs ml -1 ). Müsilajdaki prokaryotik ve viral bolluklar, çevreleyen deniz suyundan önemli ölçüde daha yüksekti (ANOVA P<0.001) (Şekil 2A). Moleküler analizler, çevreleyen deniz suyundan önemli ölçüde daha yüksek (yaklaşık iki katı; ANOVA P<0.01) bir dizi ribotip ile müsilaj içinde büyük bir bakteri çeşitliliğinin varlığını göstermiştir (Şekil 2B ve 2C). Müsilaj matrisinde karşılaşılan bakteri taksonlarının sayısı, tanımlanan toplam bakteri taksonlarının yaklaşık %68'ine katkıda bulunmuştur. Müsilajda karşılaşılan bakteri taksonlarının %90'ından fazlasının çevredeki deniz suyunda bulunmadığını bulduk.
(A) viral ve prokaryotik bolluk; (B) bakteri çeşitliliği (OTU, Operasyonel Taksonomik Birimler olarak); (C) bir müsilaj numunesinden ve çevreleyen deniz suyundan ekstrakte edilen DNA'nın elektroferogramları; (D) patojen sayısı. Panel B, bakteri topluluğunun çeşitliliğini gösterir: ortak türler aynı renk kullanılarak temsil edilir. Panel C'de, her tepe noktası ±2 baz çifti aralığına karşılık gelir, farklı bir OTU'yu temsil ettiği varsayılır ve tepe yüksekliğinin her bir OTU'nun miktarını temsil ettiği varsayılır.
Floresan in situ hibridizasyonuna dayalı moleküler analizler , müsilajın çok sayıda patojenik bakteri içerdiğini ortaya çıkardı (Şekil 2B). Deniz müsilajında birim hacim başına koliform bolluğu, çevreleyen deniz suyundan ve Vibrio spp. su sütununda olduğundan önemli ölçüde daha fazlaydı (ANOVA, p<0.01). Hem müsilaj hem de çevreleyen deniz suyu üzerinde gerçekleştirilen moleküler parmak izi tekniklerinin (ARISA) kullanımı, müsilaj kümelerinin yalnızca su sütununda bulunan prokaryotları hapsetmekle kalmayıp, aynı zamanda bakteri türlerini de ( Escherichia coli ve Vibrio harveyi ) içerdiğine dair kanıt sağladı. çevreleyen deniz suyunda.
Müsilaj salgınlarının sıklığı ve dağılımı
Tarihsel raporların analizi, son yirmi yılda Akdeniz'de müsilaj sıklığının neredeyse katlanarak arttığını göstermiştir (Figür 3). 1920'den önce müsilaj olayları yalnızca Adriyatik Denizi'nde rapor edilmiştir. 1980'den beri Ege, Kuzey ve Tiren Denizlerinden de müsilaj olayları rapor edilmiştir. Son 30 yılda en fazla müsilaj salgınının görüldüğü bölge Adriyatik Denizi (n = 14) olurken, bunu Tiren Denizi (n = 11) ve Ege Denizi (n = 9) izledi.
Son 60 yıldaki sıcaklık anomalilerinin analizi, bunların 1977'den beri 0.097 (1986) ile 0.524 (1998) arasında değişen değerlerle sürekli pozitif kaldığını ortaya koydu. Müsilaj oluşumu , son 60 yılda iklim değişikliği (sıcaklık anomalileri olarak, yıllık ortalama; www.cpc.noaa.gov ) ile önemli bir ilişki (Spearman Rank korelasyonu r s = 0.50, P<0.003; n = 34) göstermiştir .
Tartışma
Deniz hastalıklarının potansiyel taşıyıcıları olarak müsilaj
Müsilaj, küçük fitoplanktonlardan büyük zooplanktonlara kadar çok çeşitli organizmaları yüksek miktarda hapsedebilir ve su sütununda asılı duran planktonları ve kırıntılı partikülleri temizleyebilir [34] , [35] . Sonuçlarımız, 10 3 – 10 4 arasında değişen bir konsantrasyon faktörü (müsilajdaki bolluk: deniz suyundaki bolluk arasındaki oran olarak) sergileyen deniz müsilajının aynı zamanda prokaryotlar ve virüsler için önemli bir depo olduğuna dair kanıt sağlar.. Müsilajda tutulan başka hiçbir organizma bu kadar zengin değildi. Müsilaj içindeki prokaryotların ve virüslerin muazzam bolluğu, bu büyük kümelerin su sütunundan serbest yaşayan virüslere ve prokaryotlara yakalanma yeteneğinden kaynaklanıyor olabilir. Ek olarak, müsilaj, prokaryotik metabolizmayı ve büyümeyi sürdürmek için potansiyel olarak kullanılabilecek bir organik molekül kaynağını temsil eder. Su sistemlerindeki tipik olarak viral ve prokaryotik bolluklar birlikte değişir [23] . Bu aynı zamanda prokaryot ve viral bolluk arasında önemli bir korelasyonun gözlemlendiği deniz müsilajında da meydana geldi (Spearman-rank korelasyon, r s = 0.99; p<0.001). Müsilajdaki virüs-prokaryotik bolluk oranının değerleri (her zaman >17), deniz suyu için tipik olarak bildirilen değerlerden önemli ölçüde yüksekti [36] , bu, müsilajın çok daha yüksek olasılıkla güçlü bir viral şant ile karakterize edilebileceğini düşündürdü. çevredeki deniz suyundan daha virüs-konak teması [37] . Yakın zamanda, viral şantın son derece önemli olduğunun kanıtlandığı derin bentik deniz sistemleri için de benzer değerler bildirilmiştir [38] . Yüksek viral bolluk, prokaryotları öldürerek ve daha sonra müsilajın yenilenmesine ve kalıcılığına katkıda bulunabilecek partikül ve çözünmüş organik materyalin salınmasına neden olarak prokaryotik dinamikleri etkileyebilir [23] .
Parmak izi tekniklerinin kullanılması, denizdeki müsilajın aynı zamanda bakteri çeşitliliğinin önemli bir noktası olduğunu gösterdi. Müsilajdaki ribotiplerin sayısı, çevredeki deniz suyundan ortalama olarak yaklaşık %65 daha yüksekti. Müsilaj deniz suyunda aylarca askıda kalabildiğinden, müsilajın akıntılarla dağılması sırasında kökenlerinden uzak alanlarda birkaç prokaryotik türün salınması mümkündür.
Sarı leke, koyu lekeler ve hızlı doku nekrozu olarak adlandırılanlar gibi hem deniz omurgasızlarını hem de omurgalıları etkileyen bilinen hastalıkların çoğu, yalnızca semptomları için tanımlanmıştır ve etiyolojileri veya patogenezleri ile karakterize edilmemiştir [39]. . Deniz patojenlerinin ayrıntılı mikrobiyolojik araştırmaları, onları yetiştirmedeki zorluklar nedeniyle daha önce engellenmiştir. Moleküler metodolojilerin geliştirilmesi ancak son zamanlarda ilerlemeye izin verdi [40] . Bu çalışmada, floresan in situ hibridizasyon (FISH) gibi moleküler tekniklerin kullanımı, göze çarpan sayıda patojenik bakterinin (örneğin, Vibrio harveyi ) varlığını ortaya çıkardı.) müsilajda bulunur, ancak çok çeşitli organizmaları enfekte etme potansiyeline sahip olan çevredeki deniz suyunda değil [41] .
FISH analizleri , patojenlerin potansiyel varlığının yaygın göstergeleri olan çok yüksek miktarda toplam Koliform ve E. coli bolluğunun varlığını da ortaya çıkardı . Agregalarda bu bakterilerin varlığı, müsilajın insan sağlığı üzerinde potansiyel olarak olumsuz sonuçları olabileceğini düşündürmektedir. Bu bakterilerin bolluğu, su kalitesinin göstergeleri oldukları ve belirli eşik seviyelerinin üzerindeki mevcudiyetleri denizdeki eğlence faaliyetlerini sınırladıkları için tipik olarak kıyı ortamlarında izlenir. Müsilajın yüksek miktarda patojenik bakteriyi potansiyel olarak konsantre etme yeteneği, dermatitin ve müsilajla insan temasıyla ilişkili diğer sendromların ortaya çıkmasıyla tutarlıdır [42] .
Müsilajın çok sayıda patojeni barındırdığı mekanizmalar tamamen açık olmasa da, müsilajın karmaşık organik matrisinin patojenlere kolonizasyon ve hayatta kalmaları için uygun koşullara sahip mikro nişler sunduğu varsayılabilir [43] . Burada rapor edilen sonuçlar ayrıca, müsilaj oluşumunun genişlemesi gelecekte de devam edecekse, bunun müsilajdan çok sayıda patojenik bakterinin potansiyel salınımının neden olduğu artan hastalık salgınları ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.
Müsilaj ve iklim değişikliği
Akdeniz'deki tarihi raporların analizi, müsilaj olaylarının arttığını ve ilk kez belgelendiği Adriyatik Denizi'nin ötesinde birkaç bölgeye yayıldığını gösteriyor. Ege Denizi gibi oligotrofik denizlerde yakın zamanda birkaç müsilaj salgını gözlendiğinden, müsilaj ötrofik koşulların varlığı ile yakından ilişkili değildir. Ayrıca, Adriyatik Denizi'ndeki müsilaj salgınlarının sıklığı, birincil üretimde önemli bir düşüşle eş zamanlı olarak son 20 yılda artmıştır. Ayrıca, her on yıldaki müsilaj kayıtlarının sayısı ile Adriyatik Denizi'ndeki Po nehri yıllık deşarjının on yıllık ortalaması arasında bir ilişki yoktur (Spearman r s = -0.333; önemli değil, veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle varsayılabilir ki Akdeniz'in farklı alanlarda müsilaj salgınlar genişlemesi (örneğin Marmara Denizi gibi bu olay için daha önce kayıtları var kıyı bölgelerinde dahil [44] ) sistemin artan birincil üretkenlik sonucu yok (yani ötrofikasyon).
Yakın zamanda yapılan araştırmalar, 1987'de Akdeniz'de bir iklim değişikliğinin meydana geldiğini öne sürmüş olsa da (örneğin, Doğu Akdeniz Geçişi [45] ekosistem işleyişindeki bir değişiklikten sorumlu olabilirdi [46] ), müsilaj oluşumu ile iklim değişikliği arasındaki bağlantı, neredeyse tamamen ihmal edilmiştir. Akdeniz'de müsilaj görünümünün yaklaşık 60 yıllık bir kaydına (1950–2008) dayanan analizimiz, iklim anomalilerinin (örneğin, yüzey sıcaklığının pozitif anomalisi) müsilaj salgınlarındaki varyansın büyük bir bölümünü açıkladığını ortaya koymuştur. yıllık ve on yıllık bazda (Şekil 4).
Yıllık ve on yıllık sıcaklık anomalileri www.cpc.noaa.gov adresinden alınmıştır . Akdeniz'deki müsilaj görünümünün kayıtları Metin S1'de detaylandırılmıştır .
Müsilaj oluşumu ile iklim kaynaklı sıcaklık anomalileri arasındaki bir bağlantının hipotezi, bu fenomenin süresinin belirgin bir şekilde artmasıyla öne sürülmektedir. Adriyatik Denizi'nde, örneğin, deniz agregaları genellikle Mayıs'tan Temmuz'a kadar ortaya çıkar ve Yaz boyunca (Ağustos'ta bir zirve ile) müsilaj haline dönüşür. Son zamanlarda (yani, 2003, 2006, 2007 ve 2008'de), müsilaj çok daha erken ortaya çıktı (ilk olarak bölgeye bağlı olarak Kasım/Aralık ve Ocak aylarında kaydedildi). 2006-2007 Kışı, önceki ortalama sıcaklıkların 2-3°C üzerinde ortalama sıcaklıklarla son 30 yılın en sıcak dönemiydi ( http://www.noaanews.noaa.gov/stories2007/s2798.htm).) ve müsilajın mekansal kapsamı ve kalıcılığı benzeri görülmemiş seviyelere ulaştı. Örneğin Mart 2007'de, denizdeki müsilajın İtalyan kıyı şeridinin 2.500 km'den fazlasına uzandığı görüldü. Büyük agregalar neredeyse kesintisiz olarak beş aydan fazla sürdü. Son salgınlar 2008 sonbaharında rapor edilmiştir. Ancak bu eğilimin tutarlılık açısından gelecekte izlenmesi gerekmektedir.
Tek başına sıcaklık anomalilerinin varlığı, bir havza ölçeğinde müsilaj fenomeninin meydana gelişini tahmin etmek için kullanılamaz çünkü diğer birkaç (yerel) faktör müsilaj oluşumunu ve/veya hidrodinamik rejim de dahil olmak üzere bu fenomenin büyüklüğündeki artışları teşvik edebilir (örn. hız ve su kütlesi ciro), oksijen mevcudiyeti ve diğer faktörler. Bununla birlikte, iklim anomalileri ile müsilaj oluşumu arasındaki bağlantı açıktır ve Akdeniz'in ısınma eğiliminin [47] ışığında , müsilaj fenomeni gelecekte artabilir.
Akdeniz'in müsilaj görünümünden tekrar tekrar etkilenen kıyı bölgeleri birçok ortak çevre sorununu paylaşmaktadır. Bu sistemlerin çoğunun uzun bir insan sömürüsü geçmişi vardır [48] , [49] , aşırı avlanma (ki trol yoluyla bentik biyojeokimyasal döngülerin değişiminden de sorumlu olabilir) [50] , makro ve mikro - kirleticiler (mikrobiyal döngü işleyişi üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir ve viral enfeksiyonun artmasına [51] veya mikrobiyal hastalıkların salgınına neden olabilir [52]ve değişen ekosistem işleyişi. Belki de bu kıyı ortamlarının yanlış kullanımı bu fenomeni şiddetlendirebilir. Müsilaj, sırayla, hipoksik fenomeni indükleyebilir ve hatta “ekosistem mal ve hizmetlerinin” [54] üretiminin azalmasına ve daha düşük bir ekosistem esnekliğine (olumsuz etkilerden sonra iyileşme yeteneği) yol açan yaygın anoksiyi [53] teşvik edebilir .
Müsilaj fenomeni sürekli olarak sıklık ve süre bakımından artmaya ve Akdeniz'in kıyı bölgelerine yayılmaya devam ederse, bazı deniz hastalıklarının artan sıklığı ve yayılması insan sağlığı üzerinde potansiyel sonuçlar doğurabilir [55] . Geçmişte, “ Vibrio cholerae paradigması” iklim değişikliğinin insan sağlığı üzerindeki kademeli etkilerinin ilk önemli örneğini temsil ediyordu [56] . Vibrio cholera , aslında, beslenmeleri için fitoplankton çiçeklerine bağlı olan deniz kopepodlarının dış iskeletine bağlı olarak yaşar. Bunlar da iklim değişikliğinden etkilenir [56]. Müsilajı, iklim değişikliğinin sinerjik etkisinin ve deniz kaynaklarının kötüye kullanımının neden olduğu ekosistem değişikliğinin potansiyel olarak yeni bir paradigması olarak öneriyoruz. Müsilaj, bir yandan deniz ekosisteminin doğrudan ve dolaylı antropojenik etkilere karşı semptomatik tepkisini, diğer yandan da insan ve deniz organizmalarının sağlığına zararlı patojenik formlar dahil olmak üzere potansiyel olarak genişleyen bir virüs ve bakteri taşıyıcısını temsil eder.
yöntemler
Örnekleme
2007 yılında Adriyatik Denizi kıyı sularından deniz suyu ve müsilaj örnekleri sterilize edilmiş Niskin şişeleri aracılığıyla ve SCUBA dalgıçları tarafından çalıştırılan 100 mL'lik şırıngalarla toplanmıştır. Elli mL müsilaj ve deniz suyu, müteakip viral ve prokaryotik sayımlar için (48 saat içinde) hemen -20°C'de saklandı. İlave su numuneleri 0.2-um gözenek boyutlu polikarbonat filtreler üzerinde süzüldü ve DNA ekstraksiyonu için hemen taze müsilaj numuneleri ile birlikte işlendi.
Deniz suyu ve müsilajda viral ve prokaryotik bolluk ve biyolojik çeşitlilik
Viral ve prokaryotik bolluklar, SYBR Green I ile boyandıktan sonra epifloresan mikroskopi ile belirlendi ve mL deniz suyu veya müsilaj olarak normalleştirildi [37] .
Otomatik rRNA İntergenik Aralayıcı Analizi (ARISA), deniz suyu ve müsilaj numuneleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. DNA, UltraClean Soil DNA İzolasyon kiti (MoBio Laboratoires Inc., California, ABD) [57] aracılığıyla müsilaj numunelerinden (yaklaşık 1 mL) ekstrakte edildi . Çıkarılan DNA, SYBR Green I (Molecular Probes, ABD) kullanılarak florometrik olarak belirlendi ve E. coli'den elde edilen standart genomik DNA çözeltileri kullanılarak nicelendirildi [58] . DNA daha sonra evrensel bakteriyel primerler 16S-1392F ( 5′-GYACACACCGCCCCGT-3′ ) ve 23S-125R ( 5′-GGGTTBCCCCATTCRG-3′) kullanılarak amplifiye edildi.), rRNA operon artı ca bakteriyel ITS1 bölgesini yükseltir. 16S ve 23S rRNA'nın 282 bazı. Ters primer 23S-125R, florokrom HEX (MWGspa BIOTECH) ile floresan olarak etiketlendi. PCR reaksiyonları, MasterTaq® kiti (Eppendorf AG, Almanya) kullanılarak bir termal döngüleyicide (Biometra, Almanya) 50 ul hacimlerde gerçekleştirildi. 1 dakika 94°C, 1 dakika 55°C ve 2 dakika 72°C'den oluşan 30 PCR döngüsü kullanıldı, öncesinde 94°C'de 3 dakika denatürasyon ve ardından 10 dakikalık son bir uzatma yapıldı. 72°C. PCR reaktiflerinin nihai kontaminasyonunu kontrol etmek için, her PCR analizi sırasında PCR reaksiyon karışımını içeren ancak DNA şablonu içermeyen negatif kontroller çalıştırıldı. Escherichia coli'nin genomik DNA'sını içeren pozitif kontroller, da kullanıldı. PCR ürünleri, DNA boyama ve görselleştirme için etidyum bromür içeren agaroz-TBE jeli (%1) üzerinde kontrol edildi. Her müsilaj numunesi için, iki farklı PCR reaksiyonu çalıştırıldı ve daha sonra stokastik PCR önyargılarını en aza indirmek için bir araya toplandı. Bu işlem, her numune için toplam 4 farklı PCR reaksiyonu için iki kopya halinde gerçekleştirildi. Elde edilen iki PCR kombine ürünü daha sonra Wizard PCR temizleme sistemi (Promega, Wisconsin, ABD) kullanılarak saflaştırıldı, temizleme sistemiyle sağlanan 50 ul milliQ su içinde yeniden süspanse edildi ve daha sonra yukarıda açıklandığı gibi spektroflorimetrik olarak nicelendirildi. Her ARISA analizi için, yaklaşık 5 ng amplikon, deiyonize formamid içinde 14 µl dahili boyut standardı (GS2500-ROX; Applied Biosystems, Foster City, CA) ile karıştırıldı, ardından 94°C'de 2 dakika denatüre edildi ve hemen soğutuldu. buz. ARISA fragmanlarının otomatik tespiti, bir ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) kullanılarak gerçekleştirildi. 390-1400 bp aralığındaki ARISA fragmanları, Genescan analitik yazılımı 2.02 (ABI) kullanılarak belirlendi. Bakteriyel filotip/genotip zenginliği, her bir elektroferogram içindeki toplam tepe sayısı olarak ifade edildi.
Floresan Yerinde Hibridizasyon (FISH) ile patojenlerin tanımlanması
Potansiyel olarak patojenik mikroorganizmaların (yani toplam Koliformlar, Escherichia coli , Vibrio spp. ve Vibrio harveyi ) tespiti ve sayımı için bakteriyel 16S rRNA'yı hedefleyen FISH (Floresan Yerinde Hibridizasyon) tekniğini kullandık. Her örnekten, ca. Her müsilaj numunesinin 1 mL'si, 1-1 steril PBS:etanol çözeltisi içinde kopya halinde sabitlendi ve üç kez sonikasyona tabi tutuldu. Her numunenin alikuotları daha sonra uygun şekilde seyreltildi ve 0.2 um siyah polikarbonat filtrelerden (Nuclepore) süzüldü. Filtreler daha sonra her bir prob için uygun hibridizasyon koşulu altında Cy3 etiketli problar kullanılarak hibridize edildi ve uygun yıkama tamponları kullanılarak yıkandı. Daha sonra her filtre DAPI (0,5 µg mL- 1), mikroskobik slaytlara monte edildi ve epifloresan mikroskopi altında gözlendi. Total Coliforms, Escherichia coli , Vibrio spp. ve Vibrio harveyi'yi saymak için sırasıyla “D”, Colinsitu, GV, VH-2 problarını kullandık .
Tarihsel veri toplama ve istatistiksel analizler
Bu araştırmanın amaçları doğrultusunda, yayınlanmış literatürde (Sciencedirect, ASFA) dünya çapındaki okyanuslarda müsilaj ve makro agrega (>500 µm boyutunda) kayıtları aradık. Müsilaj kayıtları için yapılan araştırma, bilimsel makalelerde belgelenmeyen olayları belirlemek için İnternet'in tamamını kapsayacak şekilde genişletildi ( Tablo S1 ). Adriyatik Denizi'ndeki Po nehri deşarjına (1990–2007) ilişkin yıllık ortalama veriler, Emilia Romagna Bölgesi Önleme ve İklim için Bölgesel Ajansın Hidrolojik Annales'inden alınmıştır ( www.arpa.emr.it ).
Müsilaj ve deniz suyu numuneleri arasındaki mikrobiyal değişkenlerdeki nicel farklılıklar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak test edildi. Substrat türü (müsilaj ve deniz suyu) iki seviyeli sabit bir faktör olarak ele alındı ve önemli farklılıklar da post-hoc Student-Newman-Kuels' testi (SNK) kullanılarak değerlendirildi. ANOVA ve SNK testleri GMAV 5.0 (Sidney Üniversitesi, Avustralya) yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Müsilaj numuneleri içindeki ve deniz suyu içindeki mikrobiyal değişkenler arasındaki ilişkiler, bir Spearman-rank korelasyon analizi kullanılarak test edildi.
Destek Bilgisi
Tablo S1
Akdeniz'de müsilaj görünümünün ve belirli coğrafi konumların kayıtlarının listesi.
(0.08 MB DOC)
Metin S1
Bu dosya, Akdeniz'de müsilaj görünümüyle ilgili tarihsel olaylar hakkında toplanan tüm bilgileri içerir.
(0,07 MB DOC)
Teşekkür
Yazarlar, moleküler parmak izi analizlerindeki desteği için GM Luna'ya ve faydalı önerileri için C. Corinaldesi'ye (Polytechnic University of Marche) minnettardır. Yazıya yapılan değerli yorumlar için iki anonim yorumcuya teşekkür edilir.
Dipnotlar
Rakip Çıkarlar: Yazarlar, rekabet eden çıkarların olmadığını beyan etmişlerdir.
Finansman: Bu çalışma SESAME projesi tarafından finanse edilmiştir (AB Sözleşme No. GOCE-2006-036949). Finansörlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Yorumlar
Yorum Gönder